组织透明化应用丨《Nature Communications》应用组织透明化技术实现器官级三维染色与成像分析

文章摘要：

 

2020年EtsuoA.Susaki研究团队在Nature Communications上发表了题为"Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues"的文章。

 

研究人员通过分析染色系统的复杂物理化学环境，开发了一种高度优化的三维染色成像流程，称为CUBIC-HistoVIsion。这种技术使用多种抗体和细胞不通透的核染料，能够均匀标记整个成年小鼠大脑、成年狨猴大脑半球、约1立方厘米的死后成人小脑组织块以及整个狨猴婴儿身体。通过光片显微镜收集的整个器官的三维图像，可用于计算分析和不同物种间的整体器官比较分析。这项技术为多细胞系统的器官和生物体规模的组织学分析提供了潜在的机会。

 

 

1、经过固定和脱脂处理的组织可以被视为一种电解质凝胶

研究发现，经过甲醛固定和脱脂处理的组织，在不同的化学条件下可以反复和可逆地膨胀和收缩，这与材料科学中的凝胶行为一致。通过小角X射线散射（SAXS）分析，研究团队进一步确认了脱脂大脑的纳米级结构和化学特性，揭示了其作为电解质凝胶的本质。此外，研究还观察了固定明胶凝胶在不同离子强度、pH值和丙酮分数下膨胀-收缩行为，发现其与生物组织的电解质凝胶模型非常相似。这些发现为后续开发适用于多种抗体和染料的整体器官/身体染色协议提供了理论基础。

 

固定和脱脂处理的组织是一种电解质凝胶

 

2、开发出一种多功能的、能够用于整个器官和身体染色的染色方法

研究团队基于电解质凝胶特性的优化三维染色方法，通过调节染色液中的盐浓度和化学添加剂，实现了对整个器官和身体均匀染色的技术。该方法成功应用于小鼠大脑、狨猴大脑半球和人类小脑组织的染色，为后续的计算分析和跨物种比较提供了基础。

 

开发全器官/全身的染料染色的通用方案

 

 

3、开发出一种多功能的全器官免疫染色技术

研究通过使用固定型明胶作为组织替代物，测试了不同的染色条件，包括抗体浓度、染色缓冲液的组成以及消化酶处理等，以优化染色过程。研究发现，通过调节染色液中的离子强度、使用直接标记的一抗或一抗与二抗Fab片段复合物，以及控制染色温度，可以显著提高染色剂在组织中的渗透性和均匀性。此外，还发现限制性的组织消化可以改善抗体的边缘结合问题。

 

基于这些发现，研究人员构建了一个名为CUBIC-HistoVIsion的通用3D染色方法，能够实现对整个器官的稳定3D染色和成像。

 

全器官免疫染色通用方案的开发

 

4、CUBIC-HistoVIsion（CUBIC-HV）染色技术适用于多种抗体和染料

研究人员选用了25种抗体针对神经科学中特别感兴趣的标记物，包括神经元和胶质细胞标记物、轴突、树突和突触分子以及血管标记物。他们对整个成年小鼠大脑进行了3D染色和光片荧光显微镜成像，成功获得了具有细胞到亚细胞结构清晰度的图像。此外，该技术还允许进行多通道全器官标记，为系统化地从整体器官和全身的3D染色中获取生物信息提供了新的视角。

CUBIC-HV染色技术适用性

 

5、CUBIC-HV实现多通道全器官标记

研究人员通过结合不同的抗体和核染料，对整个小鼠大脑进行了四色染色，并使用定制的宏观变焦光片荧光显微镜（LSFM）进行了成像。他们能够清晰地区分来自不同荧光通道的信号，并且成功地将这些信号分离出来。这证明了CUBIC-HV技术与荧光蛋白（FP）标记兼容，能够进行高分辨率的三维成像，揭示了大脑中复杂的细胞网络和结构。此外，该技术还成功应用于人脑组织，显示了其在不同物种间进行组织学比较的潜力。

 

CUBIC-HV可实现多色全器官染色和成像

 

研究人员使用了不同的抗体针对特定的神经标记物，以及核染料BOBO-1进行细胞核的标记。通过这种技术，研究人员能够清晰地区分和可视化来自不同荧光通道的信号，揭示了大脑中复杂的细胞网络和结构。

 

在Thy1-YFP-H转基因小鼠大脑中，研究人员能够同时观察到YFP标记的神经元和通过免疫染色标记的其他神经标记物，从而能够进行高分辨率的三维成像。

 

CUBIC-HV可实现多色全器官染色和成像

 

6、CUBIC-HV实现对整个器官的细胞回路分析

研究人员利用该技术对整个小鼠大脑进行了多色免疫荧光染色，并结合了狂犬病病毒（RV）追踪技术，成功地在三维空间中可视化了神经网络和细胞类型。通过光片荧光显微镜（LSFM）获取了高分辨率的三维图像，并使用计算方法对图像数据进行了分析，从而能够识别和区分具有不同标记组合的单个细胞。这项技术使得研究人员能够以单细胞分辨率在全脑多模态标记数据中观察神经回路和细胞类型。

 

CUBIC-HV实现对整个器官的细胞回路分析

 

研究人员结合狂犬病病毒(RV)示踪和免疫染色，对整个小鼠大脑进行了详细的神经回路分析。他们利用CUBIC-HistoVIsion技术对大脑进行透明化处理和多色免疫荧光染色，通过光片荧光显微镜获取了高分辨率的三维图像。这些图像使得研究人员能够在单细胞水平上识别和分析神经网络，包括GABAergic神经元的局部和远程连接。

 

 

CUBIC-HV实现对整个器官的细胞回路分析

 

应用组织透明化技术实现对整个器官和生物体的详细染色和成像。通过CUBIC-HistoVIsion研究人员能够对整个成年小鼠大脑、狨猴大脑半球、人类小脑组织块以及整个狨猴婴儿身体进行均匀的三维染色。这一技术使得使用多种抗体和细胞不通透的核染料成为可能，从而在光片荧光显微镜下收集到的整个器官的三维图像可以用于计算分析和不同物种间的器官比较分析。此外，该技术还允许进行多色全器官标记，为研究复杂的神经网络和细胞电路提供了强大的工具，推动了系统化地从整体器官和全身的三维染色中获取生物信息的能力。

 

 

 

基础版透明化试剂盒

本品适用于哺乳类(人、猪、猴)和啮齿类(大鼠、小鼠) 的脑、肺、心脏、肾脏、胰腺、眼睛、胸腺、淋巴、肿瘤等组织。

 

❖ 处理时间短(小鼠脑样本为例需2-3天)

❖ 荧光染料、抗体渗透厚度可达1.5cm

❖ 操作简单，容错率高

❖ 样本结构稳定，可保存数年，重复成像

❖ 透明化程度高，可兼容内源荧光及外源荧光标记

 

 

荧光标记辅助试剂盒

本产品主要用于已通过 Hyaline^TM 组织透明化试剂完成组织通透和清洗步骤的样本，需要使用抗原抗体或染料进行荧光标记。完成样本荧光标记，随后转入组织脱水脱脂等透明化步骤。

 

❖ 荧光染料、抗体渗透厚度可达1.5cm

 

 

基础版组织透明化成像液

本产品须结合Hyaline^TM基础版组织透明化试剂盒配套使用。本成像试剂可为生物样本的三维荧光显微镜成像提供折射率匹配的液体浸润环境，以获得理想的透明化荧光成像效果，适用于光片显微镜、共聚焦、双光子等多种三维成像设备。

 

试用装

 

 

关于海卓生物

海卓生物基于国际领先的有机试剂组织透明化技术，开发出新一代国产化组织透明工具，广泛适用于各种模式动物及人的组织器官透明化，操作简单，染料和抗体渗透能力强。为科研和临床提供全套透明化解决方案。